根结线虫(Meloidogyne spp.)是严重危害农作物的病害之一，每年对果蔬产业造成700亿美元的损失(Caboni et al., 2012)。目前能有效防控线虫的药剂有限，而且一些药剂对人类及其它生物具有较高的毒性(Oka et al., 2009)，另一些药剂对寄主本身的生长发育具有不良影响(Mafeo and Mashela, 2009)，还有一些药剂能显著影响生物多样性(Eisenhauera et al., 2010)。正是诸如此类的种种局限，严重阻碍了线虫病害防控研究工作的进展。

年来，基因组学与生物信息学已经广泛地应用于植物病害的研究中(Leal-Bertioli et al., 2009)，为植物病害的防控研究提供了新的研究思路。RNA干扰(RNAi)是验证基因功能的一个重要途径，并已经已成功应用于模式线虫秀丽杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)功能基因组研究中(Kamath et al., 2003; Parry et al., 2007)。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术利用植物RNAi介导的抗病毒防卫机制(Velásquez et al., 2009)，为研究基因功能研究的提供了一种有效途径(Becker and Lange, 2010; Senthil-Kumar and Mysore, 2011)。南方根结线虫(Meloidogyne incongnita, M. incongnita)与北方根结线虫(Meloidogyne hapla, M. hapla)基因组的测序为线虫相关研究工作提供了宝贵信息(Abad et al., 2008; Opperman et al., 2008)。在前期的工作中，利用M. incongnita、M. hapla和C. elegans基因组序列及wormbase 库中RNAi数据，通过生物信息学方法，对根结线虫的功能靶标基因进行预测，得到了一批候选靶标基因。其中包括线粒体ATP合成酶基因，该酶是氧化磷酸化(OXPHOS)呼吸链系统的第Ⅴ个酶，通过质子电化学梯度产生的能量催化ADP合成ATP。而线粒体产生的ATP是细胞内代谢途径的主要能量来源(Wittig and Schägger, 2009; Jonckheere et al., 2012)。

本研究是在前期基因组预测的基础上，对M. incongnita中编码线粒体ATP合成酶g亚基基因(MiAsg)进行分子克隆，对其序列进行分析，并通过烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)介导的VIGS技术，研究该基因沉默对根结线虫病害的抑制作用，以期探明MiAsg基因与根结线虫病害的关系，为根结线虫防控研究提供新的思路及理论依据。

1结果与分析
1.1 MiAsg基因的获得及其序列特性分析
以M. incongnita二龄幼虫(J2)总RNA为模板，用AsgF/AsgR (表1)进行特异PCR，获得了约400 bp目的条带(图1)。将扩增片段克隆到pGM-T上进行测序发现，该片段长约351 bp，其中A为28.21% (99 bp)、T为30.20% (106 bp)、C为17.66% (62 bp)、G为29.23% (84 bp)。包含一个完整ORF (1~351 bp)，编码116个氨基酸，其MW为13.77 kD，pI=9.52,其中强碱性氨基酸18个(K, R)，强酸性氨基酸13个(D, E)，疏水性氨基酸46个(A, I, L, F, W, V)，极性氨基酸20个(N, C, Q, S, T, Y)。将克隆得到的MiAsg候选基因与预测的Asg基因的核苷酸进行比对分析发现，两个序列在最后一位不同，中间部分相似性为100% (350/350)。克隆得到的MiAsg候选基因在该处为A，与前两个核苷酸形成终止密码子TAA，而预测的MiAsg基因在该处为G，该核苷酸与前两个形成终止密码子TAG，所以两个序列编码的氨基酸相似性高达100% (116/116) (图2)。因此认定该基因为MiAsg (其核苷酸在GenBank的登录号为JQ284057, 编码的蛋白质登录号为AFG25446)。

表1 实验中用到的引物序列 Table 1 Sequence of primers used in the experiment

图1 MiAsg基因的PCR扩增片段 注: M: Trans 2k plus DNA marker; 1: MiAsg候选基因片段 Figure 1 The amplified fragments of MiAsg candidate genes Note: M: Trans 2k plus DNA marker; 1: Gene fragment of MiAsg

图2 克隆的MiAsg基因与预测的MiAsg基因编码的氨基酸序列比对分析 Figure 2 Alignment of amino acid sequence encoded by the cloned and the predicted MiAsg genes

1.2 MiAsg与其它线虫类Asg的进化关系分析
将MiAsg基因编码的氨基酸序列在NCBI上进行Protein blast，发现Score值≥100氨基酸有11个，这11个氨基酸序列都属于线虫类，分别来自Ascaris属、Caenorhabditis属和Brugia属。从进化关系上看(图3)，在这12个序列中，来自Caenorhabditis属的8个基因(EGT37935.1, EGT53011, XP_002639628, XP_ 002644949, NP_492352, NP_509152, XP_003112311.1和XP_003117690)组成一小组，然后与本研究克隆到的Meloidogyne属的MiAsg序列(AFG25446.1)聚合成一大类，植物线虫类；来自Loa属和Brugia属的XP_003139824和XP_001899229聚为一个小组，然后与来自Ascaris属的ADY42749合成第二大类，动物线虫类。

图3 MiAsg与其它线虫类Asg氨基酸序列的进化树分析 注: 1: EGT53011 (Caenorhabditis brenneri, USA); 2: NP_509152 (Caenorhabditis elegans, UK); 3: XP_002644949 (Caenorhabditis briggsae, USA); 4: XP_003117690 (Caenorhabditis remanei, USA); 5: XP_002639628 (Caenorhabditis briggsae, USA); 6: EGT3-7935.1 (Caenorhabditis brenneri, USA); 7: XP_003112311.1 (Caenorhabditis remanei, USA); 8: NP_492352 (Caenorhabditis elegans, UK); 9: AFG25446 (Meloidogyne incognita, CHN); 10: ADY42749 (Ascaris suum, USA); 11: XP_001899229 (Brugia malayi, USA); 12: XP_003139824 (Loa loa, USA) Figure 3 The phylogenetic tree constructed by amino acid sequ- ence of MiAsg and other nematode species Note: 1: EGT53011 (Caenorhabditis brenneri, USA); 2: NP_509152 (Caenorhabditis elegans, UK); 3: XP_002644949 (Caenorhabditis briggsae, USA); 4: XP_003117690 (Caenorhabditis remanei, USA); 5: XP_002639628 (Caenorhabditis briggsae, USA); 6: EGT37935.1 (Caenorhabditis brenneri, USA); 7: XP_003112311.1 (Caenorhabditis remanei, USA); 8: NP_492352 (Caenorhabditis elegans, UK); 9: AFG25446 (Meloidogyne incognita, CHN); 10: ADY42749 (Ascaris suum, USA); 11: XP_001899229 (Brugia malayi, USA); 12: XP_003139824 (Loa loa, USA)

1.3 pTV-MiAsgi沉默载体构建
以含有1.2中克隆得到的MiAsg基因的pGM-T为模板，以引入酶切位点的特异引物AsgiF/AsgiR (表1)进行PCR。将获得的片段重新连接到pGM-T载体上，将转入大肠杆菌，挑选阳性克隆进行测序后，获得了351 bp的MiAsg基因。用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切含有新克隆的MiAsg基因的pGM-T载体，将得到的小片段连接到相同酶切的pTV00上，构建成含有MiAsg基因的TRV介导的VIGS沉默载体(图4)，经过酶切鉴定后命名为pTV-MiAsgi (图5)。

图4 pTV-MiAsgi沉默载体图谱 Figure 4 Diagram of pTV-MiAsgi silence vector

图5 pTV-MiAsgi沉默载体构建的酶切鉴定 注: M1: Trans 15k plus DNA marker; M2: Trans 2k plus DNA marker; 1: pTV-MiAsgi Figure 5 Identification of pTV-MiAsgi silence vectors by digesting using double restriction endonucleases Note: M1: Trans 15k plus DNA marker; M2: Trans 2k plus DNA marker; 1: pTV-MiAsgi

1.4 MiAsg基因沉默对根结线虫病害的防控效果
接种M. incongnita 60 d后，pTV-MiAsgi沉默载体处理的番茄植株与空载体处理及清水处理的番茄苗都有根结形成，但与沉默载体处理相比，空载体和清水对照根结数量更多，根结更大，而且肿大成串明显(图6)。MiAsg基因沉默处理的番茄苗根结数与对照有明显区别，沉默处理的番茄根结数变幅在17~31个之间，而在空载体和清水对照中根结数变幅在48~83个之间(图7A)。对根结数的统计分析表明，各个处理间存在显著的差异性(P<0.000 1)。空载体和清水处理番茄苗平均根结数分别为62.4个和62.2个，而pTV-MiAsgi沉默载体处理的番茄苗平均根结数为25.2个。与空载体对照相比，根结数下降了59.6%；与清水对照相比，根结数降低了59.5% (图7B)。这个结果说明MiAsg基因沉默对线虫病具有显著的防控效果。

图6 TRV介导MiAsg基因沉默的番茄植株根部表型 注: A: pTV-MiAsgi; B: pTV00; C: H2O Figure 6 Phenotype of underground parts of MiAsg gene silenced tomato plantlet mediated by TRV Note: A: pTV-MiAsgi; B: pTV00; C: H2O

图7 TRV介导的MiAsg基因沉默的番茄植株的根结数 Figure 7 Amounts of root knot on MiAsg gene silence-treated tomato plantlet mediated by TRV

2讨论
本研究利用线虫基因组数据，通过生物信息学方法对根结线虫中功能基因进行预测，得到了一批线虫功能候选基因。本研究对预测到的MiAsg基因进行了克隆，并通过TRV介导的VIGS技术研究了该基因在番茄植株上的沉默效应，证明了MiAsg基因沉默能减少M. incongnita病害的发生，也说明了MiAsg基因与其致病性相关，该研究为线虫的防控提供了新的途径。

基因组学与生物信息学的出现，为植物病害相关分子生物学研究提供了有利条件。从基因组数据出发，通过生物信息学方法进行预测分析，已成为挖掘新基因的重要手段(Smits et al., 2010; Patel et al., 2012)。本研究正是从这种思路出发，在前期研究中对C. elegans、M. incognita和M. hapla线虫基因组进行分析，对其中的功能基因进行预测，以期挖掘出对线虫病害有抑制作用的基因。本研究克隆到了与前期预测相一致的MiAsg基因，证实了MiAsg基因预测的准确性，达到了预期研究目的。

线粒体ATP合成酶又称F₁F₀-ATP合酶，细胞必需的ATP中，大部分都是由该酶催化合成(Ballmoos et al., 2009)。ATP合成酶由许多亚基因组成，前人研究表明：缺乏其中的部分亚基能使其丧失功能，以至于影响ATP的正常合成。酵母菌中缺乏ε、δ和γ亚基，ATP合成酶能够组装，但是质子转运通道受阻，不能合成ATP (Mueller, 2000)；如果缺乏α或者β亚基，ATP合成酶不能正确组装，F₀亚基的质子通道也会失去功能，因而也不能正常合成ATP (Liang and Ackerman, 1996; Lefebvre-Legendre et al., 2001; 2005); 在C. reinhardtii中，通过RNAi技术沉默ATP2基因(编码β亚基)后，导致线粒体的形态和功能发生改变(Lapaille et al., 2010)。在本研究中，我们通过VIGS技术沉默了M. incongnita中编码线粒体ATP合成酶g亚基的Asg基因，接种M. incongnita的番茄植株的根结数显著下降。在线粒体ATP合成酶中，虽然g亚基不参于ATP的合成，但其参与线粒体ATP合成酶的二聚/寡聚化作用，在缺失g亚基的突变体中，ATPase失去了形成超分子结构的能力，而ATP合成酶形成超分子结构的能力决定了线粒体的内部结构，因而影响了线粒体中ATP的合成(Arselin et al., 2004)。

在该研究中，TRV入侵启动了番茄中的RNAi机制，导致其根结中形成了大量与MiAsg基因同源的siRNAs，而这些siRNAs通过M. incongnita的吞食作用进入线虫体内；另外，M. incongnita也有可能吞食dsRNA (Dubreuil et al., 2009)，使得M. incongnita的部分Asg基因沉默，导致g亚基的功能下降，因而影响了线粒体的超分子结构的形成，减少了线粒体嵴的形成，从而降低了ATP的合成能力，进而影响了线虫的生长、发育和侵染等生命活动，最终降低了病害的发生，这与前人在拟南芥中对包囊线虫(Valentine et al., 2007)及在烟草中对根结线虫(Dubreuil et al., 2009)进行的TRV介导的VIGS效应一致。这结果也说明MiAsg基因沉默可以显著降低线虫病害，也说明MiAsg基因参与线虫的致病性。该研究为线虫病害的防控提供了新的思路及途径，对进一步研究线虫致病机理及线虫的防控都具有重要意义。

3材料与方法
3.1实验材料
M. incongnita、植物材料丽春番茄(Lycopersiconesculentum Mill.cv.Lichun)、载体pBINTRA6、载体pTV00、大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101等菌株均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所病理研究室保存。

3.2 MiAsg基因克隆及其序列特征分析
按照Trizol试剂法提取M.incongnita J2总RNA，并按照SuperScript^TM Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)试剂盒说明合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，以特异引物AsgF/AsgR (根据预测到的MiAsg基因设计; 表1)进行特异性扩增，回收PCR产物，将获得的特异性扩增片段连接到pGM-T载体上，连接反应产物转化大肠杆菌E. coli DH5α，蓝白斑筛选后(萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)，挑取阳性克隆送英潍捷基(中国)贸易有限公司进行测序。利用DNAMAN7.0和DNASTAR7.0软件对克隆到的MiAsg序列进行分析，利用MEGA5.1软件进行同源性分析，并用邻接法(Neghbor-joining, NJ)构建系统进化树。

3.3 VIGS重组载体构建
在引物AsgF/AsgR的两端分别引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点及保护碱基，得到特异引物AsgiF/AsgiR (表1)，以含有1.2中克隆到的MiAsg基因的pGM-T为模板进行PCR，将PCR产物连接重新连接到pGM-T载体上，将其转入大肠杆菌E. coli DH5α，经过蓝白斑筛选后(萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)，挑选阳性克隆进行测序。测序确认后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ (TAKARA公司)酶切含有MiAsg基因的pGM-T载体进行酶切，回收候选基因片段，并将其连接到相同酶切的pTV00载体上，构建含有MiAsg基因片段的pTV-Asgi的沉默载体。

3.4 VIGS操作及靶标基因沉默效应
VIGS操作参照文献(崔艳红等, 2009; Velásquez et al., 2009)进行，稍有修改。首先通过电转化方法(萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)将pTV-Asgi和pBINTR6载体转入到农杆菌GV3101，并在LB液体培养基上培养至OD值约为0.6后，3 000 r/min离心10 min收集菌体，用等体积MMA缓冲液(10 mmol/L MgCl₂, 150 mmol/L乙酰丁香酮, 10 mmol/L MES)再次悬浮，25℃震荡培养3 h后1:1混合。然后选取4~5叶龄的番茄苗，用不带针头的5 mL注射器将混合菌液从背面注射渗入番茄叶片，使菌液充满整个叶片，每棵苗注射2~3片叶子。同时以空载体pTV00和清水代替沉默载体处理的番茄植株为两个对照组。注射完毕后，将处理和两个对照组植株在温度16℃的培养箱内，50% RH，黑暗培养24 h后，转入到温度为20℃~ 22℃的环境内，光照16 h/8 h，50% RH。7 d后，接种M. incongnita 200条/株，同样条件继续培养60 d后，小心取出各处理的根系，观察并统计根结数量，以评价MiAsg基因沉默对根结线虫病害的防控效应。

作者贡献
梅眉和黄永红是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析和论文初稿的写作；茆振川参与实验设计，试验结果分析；谢丙炎和刘志敏是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家重点基础发展计划项目(2009CB119000)、公益性行业(农业)科研专项(201103018)、国家自然科学基金重点项目(31030057)和国家大宗蔬菜产业技术体系项目(CARS-25)共同资助。

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